文献分享# 基因调控文库筛选思路,发现病毒侵染途径中的关键因素
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基因调控文库筛选思路,发现病毒侵染途径中的关键因素 自2003年爆发的SARS,至今的冠状病毒2019-nCoV,这类的严重疾病罪魁祸首冠状病毒,其基因组为线性单股正链的RNA病毒,具有高突变率和快速适应的潜力,那么病毒的耐药性对于抗病毒药物的研发则是一个严峻的考验。而对于靶向细胞的功能,相较于靶向病毒功能的研究,能够更大程度减少耐药性的发展。结合病毒在其复制周期中,与宿主细胞在多层面上的相互作用,则是其抗病毒感染的关键因素,从而可作为药物开发的抗病毒策略。
以人激酶组为靶点,利用siRNA文库筛选影响SARS冠状病毒复制的主要因素
通过对GFP荧光表达值分析,发现在同时下调779个基因mRNA的前提下感染重组SARS-CoV-GFP,并同时设置无任何靶基因敲低并感染重组SARS-CoV-GFP的对照组,发现有38个基因的下调表达后,与对照组相比其GFP表达增加至少1.5倍,有10个基因的下调表达后相较于对照组GFP表达下降至少2倍以上。
初步将这些通过siRNA文库筛选得到的关键基因结合IPA软件分析,其不仅发挥抗病毒或病毒前体复制的关键作用,同时也参与多种细胞途径,如细胞凋亡、细胞免疫应答、生长因子信号传导、细胞稳态、复杂脂质的代谢以及细胞内和第二信使信号传导。
通过前期siRNA文库筛选得出,COPB2的下调表达后感染SARS-CoV-GFP 重组病毒,其荧光报告基因GFP表达下调82%,由此推断COPB2作为病毒前体复制的最为关键因素。
COPB2作为涂层蛋白复合物的其中一个亚基,可驱动形成COPI涂层的囊泡,在早期分泌途径中发挥逆行转运作用,同时在这一过程中,GBF1激活ADP-核糖激化因子1介导COPI包被的囊泡形成,而COPB1和GBF1作为早期分泌途径的蛋白质,对于SARS-CoV复制同样很重要。为进一步证实COPI包被的囊泡对SARS-CoV复制的重要性,针对COPB1和GBF1分别转染其特异性siRNA至293 / ACE2细胞,于48h后分别敲低表达水平,感染SARS-CoV-GFP(MOI 10),并于24h后重组病毒GFP表达量降低约83%(COPB1)和89%(GBF1) (Fig 1E)。
该篇文献利用系统功能基因组学的方式筛选得出影响SARS-CoV感染宿主的关键因子PKR和COPB2,并通过基因调控结合SARS-CoV感染所发生的表型或表达情况等,进一步证实了宿主PKR和COPB2在其病毒侵染宿主过程中发挥的抗病毒及影响病毒前体复制关键作用。并且文章中也提及到,利用该种方式不仅针对SARS-CoV,还确定了多种RNA病毒复制的关键因素。为后续进一步深入的探讨提供了一个数据起点及理论基础,帮助病毒侵染宿主过程中新靶点的发现,以及后续的抗病毒治疗等。 文献使用产品 Dharmacon提供RNAi/CRISPR/过表达、以及非编码lncRNA/microRNA调控产品,涵盖人或小鼠种属,全基因组范围或各基因家族范围(可支持定制)。具体如下:
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